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蛋白质和多肽反相HPLC分析和纯化指南一
点击次数:152 发布时间:2019-06-12

引言

反相HPLC已成为分离和分析蛋白质和多肽的重要工具。

它在生物技术行业中被广泛应用于蛋白质类治疗产品的表征,以及这些产品和杂质的鉴定。

在通过质谱鉴定蛋白质之前,反相HPLC在从消化后的蛋白质组中分离多肽方面有着至关重要的作用。

它也被用于探索性研究中多种蛋白质和多肽的纯化,以及蛋白类治疗药物的大规模纯化。

 

反相HPLC灵敏、通用性强,还可与质谱等技术结合使用,在蛋白质研究中具有重要的地位。

此外,它还能够分离结构近乎相同的蛋白质,因而得到了广泛的应用。

正如牛、人和猪胰岛素变异体的分离过程所示(图1),反相HPLC能够分离非常相似的蛋白质。

牛胰岛素和人胰岛素仅有三个氨基酸的差别,也能够被完全分离开来。

牛胰岛素在胰岛素a链的第8位为丙氨酸,第10位为缬氨酸,b链的第30位为丙氨酸。

而人胰岛素在胰岛素a链的第8位为苏氨酸,第10位为异亮氨酸,b链的第30位为苏氨酸。

 

1. RP-HPLC对紧密关联的胰岛素变异体进行分离

 

条件

色谱柱:ACE 5 C18,4.6 x 250mm

洗脱液:含有29.3 - 31.7% 乙腈的 0.1% 三氟yi酸溶液,以1.0毫升/分钟的速率洗脱至少16分钟

样品:牛、人和猪胰岛素

 

 


 

猪胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异(猪胰岛素的b链第30位为丙氨酸,人胰岛素该位置为苏氨酸),在基线即已分离。

在另一个实例中,尽管兔胰岛素和人胰岛素仅有一个氨基酸的差异,即以苏氨酸取代了丝氨酸,但也同样得到了分离(参考文献1)。

 

反相HPLC的高分离能力也被扩展应用到了多肽上。

在图2中,两种多肽尽管只有一个氨基酸的差异,即丝氨酸对苏氨酸,但也得到了完全的分离。

这种高分离能力是反相HPLC在蛋白质和多肽分离中得到广泛应用的基础性因素。

 

2. RP-HPLC对紧密关联的多肽进行分离。仅有一个氨基酸不同的两种十肽菌素,一种含丝氨酸,而另一种含苏氨酸

条件

 

色谱柱:C18 宽孔柱, 4.6 x 250 毫米

 

洗脱液:

 

A. 含有0.1%三氟yi酸的水溶液

 

B. 含有0.08%三氟yi酸的乙腈溶液

 

梯度:0 - 35%B溶液超过73分钟(参考文献2

 

蛋白质/多肽的保留机制

在反相HPLC中,颗粒表面是十分疏水的,因为其表面通过化学连接有羟基(图3中的波浪形红线)。

通过疏水表面对蛋白质一面(被称为疏水性足)的吸附,蛋白质被保留下来(图3)。

与疏水表面的厚度相比,蛋白质要大得多,因此蛋白质仅有一部分被疏水表面所吸附。

大部分蛋白质位于表面上方并与流动相接触。

由这种疏水性吸附所导致的净相互作用非常强,会导致蛋白质保持吸附在表面上(图4A),直至接触到特定浓度的有机溶剂,这时蛋白质会从表面上解吸附并从色谱柱上洗脱(图4B)。

在最初的吸附/解吸附之后,尽管蛋白质在从色谱柱上移动下来时仍会与表面产生一些相互作用,但却是十分微弱的,对分离过程无影响。

分离是由单次吸附/解吸附过程完成的。

解吸蛋白质所需要的有机改性剂的浓度十分精确,并与疏水足的大小呈函数关系。

详情请参阅参考文献3

 

4. 进入色谱柱的蛋白质被吸附在柱顶端附近的疏水表面上(A)并且一直保持吸附,直至有机改性剂的浓度达到特定值,此时蛋白质从表面解吸附(B)。

 

反相HPLC中,吸附/解吸保留机制导致蛋白质的保留行为与小分子不同。

小分子的保留行为随着有机溶剂浓度的改变而缓慢改变时(图5,联苯),一旦有机溶剂的浓度达到所需要的值,蛋白质的保留行为即发生突然改变,引起保留时间的快速变化(图5,蛋白质)。

该过程产生的尖锐峰形常见于蛋白质和多肽(图6A)。

由于有机溶剂浓度的微小变化会引起的显著的保留行为变化,等度洗脱很少被用于蛋白质中,因为峰变宽了,而有机溶剂的微小改变会导致蛋白质保留行为的巨大变化(图6B)。

5.有机溶剂浓度对应的保留行为

 


 

6.

A. 梯度洗脱过程中多肽和蛋白质洗脱出尖锐峰形。

B. 等度洗脱下,蛋白质的峰形(本例中为溶菌酶)很宽,有机溶剂的微小改变都会引起保留时间的巨大变化。

 

 

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