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产品名称:ACE C18-PFP色谱柱

产品型号:

产品报价:

产品特点:ACE色谱柱具有特别选择性的C18键合相
有保证的可重现性
极佳的键合相稳定性
疏水和五氟苯基“混合模式"的相互作用

ACE C18-PFP色谱柱的详细资料:

探索ACE C18-PFP色谱柱的优势:
一种特别的C18键合HPLC色谱柱, 具有五氟苯基(PFP)相的额外选择性

  • 将C18和PFP分离机制相结合来分离任一单独相不可能实现分离的混合物
  • 改善极性碱性化合物的保留以获得更佳的分离效果
  • 超惰性、超高纯度硅胶具有卓越的峰形和可重现性
  • 为高温应用提供极佳的键合相稳定性
  • 超低流失相可以确保UV和LC/MS的兼容性
  • 可获得高通量色谱柱尺寸

 

为什么需要另一种新的C18相?
使用超纯、超惰性硅胶具有许多公认的优点,包括改善可重现性、寿命和色谱性能(特别是碱性分子)。

然而,由于超惰性硅胶表面不再有效促进分离,所以用高纯度硅胶制造的C18柱可以显示出接近相同的选择性。

因此,通过改用替代制造商的同等产品,一个刢先品牌的问题分离很可能不会得到显著改善。
多年来,经验丰富的色谱学家们一直在寻求由这样刢先的C18色谱柱品牌展示的、具有可靠性能和可重现性优点的相,但另外也为他们的挑战性应用提供了所需的替代选择性。

 

ACE C18-PFP色谱柱有何不同?
C18键合相目前主导着HPLC市场,最近的调查显示,它们仍然占据了所有HPLC色谱柱销售量的50-60%。

近年来,由于其提供的替代选择性,五氟苯基(PFP)键合相的使用显著增长。
然而,与C18键合相相比,PFP相传统上受疏水性降低、稳定性降低和显著柱流失的影响。
ACE C18-PFP相利用一种特别开发的配体,将C18链与完整PFP官能团相结合,形成可以保持刢先C18相的疏水性、稳定性和低流失特性的相,同时也提供了PFP相的多重保留机制以实现ACE C18-PFP色谱柱的特别选择性。
“ACE C18-PFP色谱柱是一种有价值的方法开发工具 - 是将C18保留性和稳定性与PFP选择性相结合的色谱柱”
刢先制药公司的研发团队刢导者

ACE C18-PFP色谱柱显示出对C18键合色谱柱的替代选择性

ACE C18-PFP色谱柱

 

化合物:1)1,2,3-三甲氧基苯2)1,2,4-三甲氧基苯3)1,2-二甲氧基苯

色谱柱150 x 4.6 mm, 5μm

流速:1.00 ml/min

温度:40°C

检测:UV, 254 nm
流动相:50:50 v/v 甲醇/水

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

何时应用ACE C18-PFP?
由于其相似的疏水特性,ACE C18-PFP色谱柱可用于通常会考虑“标准”C18色谱柱的应用中。

然而,由于其完整的五氟苯基官能团,ACE C18-PFP还被推荐用于涉及卤代芳族化合物、位置异构体和具有不同形状约束的分析物的分离。
本手册中包含的应用证实,ACE C18-PFP可用于改善C18色谱柱上存在问题的分离。特别的ACE C18-PFP相为C18色谱柱提供了替代选择性,但对规定为C18键合色谱柱的方法,保留了有效的选择。

在许多情况下,证实不适合C18色谱柱的相同评估条件被证实适用于C18-PFP色谱柱,这就避免了冗长的方法再开发。

 

改善色谱分离度
色谱分离的目标是在最短的时间内获得目标组分的足够分离度(Rs)。

1.5的分离度可以实现基线分离,然而对于可以在实验室之间易于转换的耐用、可重复方法而言,理想的分离度是1.8-2.0。
分离度方程告诉我们什么变量可以影响分离度:

增加分离度Rs可以通过增加N、α或k来实现。

然而,如图1所示,可以看出,增加N或k以改善Rs的回报率快速下降。

例如,Rs仅随着N平方根的增加而增加。

可以通过增加柱长或降低柱填充材料的粒径或两者的某种组合来增加N。

无论哪种方式,系统背压随着N的增加而增加,因此通过增加N实现令人满意的分离,其“成本”可能是极高的压力。
同样,增加保留值(k值)将会增加Rs,但回报率也快速下降。

将k增加至超过10通常是Rs与分析时间之间的不利权衡,因为只有Rs的边际收益随着保留时间的增加而实现。

该效应的图形表示参见下述图1。

增加α可以增加Rs,但不同于N和k,不会受回报率下降的约束。

α的变化对压力没有影响,对分离时间的影响也是微乎其微的(参见图2)。

因此,在开发分离方法时,α是最重要的变数。

优化α可以使您在所有目标峰之间达到满意的分离度,同时保持系统背压和分离时间在可接受范围内。

 

改善色谱分离度 - 选择性或柱效?
选择性(α)由流动相、温度和固定相化学物质控制。

大多数方法开发策略将探索所有这些色谱变量。
如果使用“标准”3μm C18相没有达到足够的分离度,推荐优化分离的色谱选择性而不是分离柱效,如下述实例所示。
通过简单地将固定相化学物质(即色谱柱)改变为具有替代色谱选择性的固定相化学物质,易于在标准HPLC系统上获得所需分离度,而无需昂贵的UHPLC仪器。

另外,也可以避免复杂的流动相组分、升高的温度和侵蚀性pH条件。

在保持C18键合相的同时,将粒径从3μm减小至2μm以下,并不能显著改善分离效果,另外也会导致压力明显增加。
ACE C18-PFP色谱柱为3个关键对提供了更佳的选择性(α),因此与2μm以下的C18色谱柱相比,其可以提供极佳的分离效果,即使2μm以下的色谱柱可以提供更高的柱效。
与使用具有高塔板数和高压的色谱柱尝试进行峰分离所获得的结果相比,利用选择性的能力可以获得更佳的分离效果。

 

PFP分离机制
ACE C18-PFP相显示有多个保留机制,包括疏水性、π-π相互作用、偶极-偶极、氢键和形状选择性。

虽然下述部分提供了相对强度的近似值,但每个保留机制的优势由溶质的物理/化学性质、其结构和所采用的色谱条件决定。

 

π-π相互作用


PFP环在相的表面上加入了芳香特性。

然而,PFP相不同于苯基相,因为电负性氟原子会产生缺电子的苯环,使得PFP相可以作为路易斯酸而起作用。

这将与能够给出电子的分析物(即路易斯碱)相互作用。
这与苯基相相反,苯基相含有富电子芳香环(由于不存在吸电子基团),因此它们可以作为路易斯碱而起作用。

 

偶极-偶极和氢键

 

PFP环中的碳-氟键具有强极性。

因此,PFP相可以通过在分析物与电负性氟原子之间发生的偶极-偶极或氢键相互作用来额外保留分析物。

任何这样的相互作用将导致保留增加。

 

形状选择性

PFP具有刚性环结构,当与其它可能的保持机制相结合时,可以赋予PFP相优异的形状选择性。

 

ACE C18-PFP相显示有PFP相的多重保留机制,色谱科学家们可能会利用这些机制来解决在传统C18相(仅主要依赖于疏水保留机制)上难以分离(即使并非不可能)的混合物。

 

 

应用#1 取代的甲氧基苯异构体- 刢先的C18色谱柱

 

上述实例突出了以下事实:刢先的C18品牌可以提供相似的选择性,并且均无法分离三、二和单甲氧基苯异构体。

绝对保留值的差异(如中性参考标记所示)是由于纯粹的疏水作用并与母体硅胶特性(例如:表面积)相关。
由于特别的ACE C18-PFP配体中包含完整的PFP官能团,ACE C18-PFP对所有组分都表现出极佳的分离度。

 

应用#2 取代的甲氧基苯异构体- PFP色谱柱

 

上述应用强调了五氟苯基相在位置异构体分离中的用途。如之前在第5页中所示,标准C18相无法分离出三、二和单甲氧基苯异构体。
传统的PFP相可以提供替代选择性,但是以疏水性的显著降低为代价,这就影响了分离效果。
ACE C18-PFP可以保持C18相的疏水性,并提供极佳的分离效果,从而可以进一步优化以减少分析时间。

 

 

 

应用#3 取代的二硝基苯异构体

 

 

该测试包含芳香族二硝基苯异构体,在简单的等度条件下进行,强调当这些相具有相似的疏水性时,与C18相相比,对二硝基苯异构体,C18-PFP相显示出不同的色谱选择性(通过增强的偶极-偶极相互作用)。
C18相不能在这些条件下实现异构体的分离,而C18-PFP由于其完整的PFP官能团可以提供额外的保留机制,从而实现了所有异构体的基线分离。

 

 

应用#4 药学相关分析物

 

 

上述应用显示在ACE C18色谱柱上分离一系列药物活性分析物时,可以观察到2组共洗脱峰。

在ACE C18上的该分离也与其他刢先的C18柱品牌可以预期的结果相同,由于相同(主要是疏水性)的保留机制,它们显示选择性极为相似。
换成典型的PFP相可以导致选择性发生变化,但是产生不同的关键对。
我们发现,经证实不适合ACE C18和典型PFP相的相同评估条件可以适用于ACE C18-PFP色谱柱,其能够实现所有17个组分的分离,包括之前确定的所有关键对。

 

应用#5 结构不同的分析物

基于与ACE C18相同的超惰性、超高纯度硅胶平台,特别的ACE C18-PFP相再次提供了替代选择性来使所有13种结构不同的分析物实现极佳分离,同时无需冗长的方法重开发。

 

应用#6 酸性分析物

 

与典型的C18相相比,由ACE C18-PFP相提供的额外保留机制可以产生显著不同的色谱选择性,包括峰洗脱顺序中的许多逆转。

 

应用#7 - 儿茶酚胺

 

 

儿茶酚胺的该分离效果阐明,与通过具有弱疏水性相互作用的典型PFP所实现的分离结果相比,ACE C18-PFP上的强疏水性相互作用可以实现左旋多巴和肾上腺素的更佳分离。

 

 

 

结论
当分析吡啶(一种高碱性小分子)时,可以看到柱效、峰形和选择性的显著差异。
拖尾和保留增加表明,吡啶和固定相上表面的硅醇基之间存在不受欢迎的次级相互作用。

这些相互作用也可能导致色谱柱可重现性不佳。
之前已对ACE C18色谱柱进行了独立测试,发现具有出色的柱效和季致的惰性。

新型ACE C18-PFP保持了这一优异性能。

ACE®固定相几乎消除了硅醇基对HPLC分离的不利影响

 

 

 

优良的温度和pH稳定性
在低pH值时,色谱柱退化是由键合相的水解所致,同时观察到保留值降低。

键合相的性质、硅胶表面的纯度和键合密度都是关键参数。

使用较低纯度的硅胶、较短的配体和较低的键合密度都是有助于加速配体断裂和降低柱寿命的因素。

 

 

使用设计用于加速色谱柱降解的条件,ACE C18-PFP相显示保留损失极少,其寿命相当于高度稳定的ACE C18相,这表明ACE C18-PFP可能适用于PFP色谱柱显示寿命缩短的应用。
正如预期,基于中等纯度硅胶的C18键合色谱柱(Zorbax SB-C18——之前被认为可以为高温和低pH应用提供优异稳定性的一种相)和低纯度硅胶(Waters Spherisorb ODS2)显示寿命显著降低。

 

 

 

有保证的可重现性和完全可扩展性
与替代选择性同等重要的是卓越的可重现性。

固定相不同批次之间的变化是客户关注的最常见原因。

ACE固定相通过保持对整个制造过程的严格控制并建立纯度、选择性、保留值、柱效和不对称性的严格规范,几乎完全消除硅醇基对HPLC分离的不可预测的不利影响。

因此,如下图所示,所有ACE C18-PFP色谱柱均可以保证批次间和柱间的绝对可重现性。

 

 

将可用的3μm、5μm和10μm粒径与从毛细管到制备规模的一系列柱尺寸相结合,可确保方法可重现地放大或缩小。

上述色谱图显示,当硅胶批次和硅烷批次改变时可以获得卓越的可重现性,并当粒径和柱直径改变时可以获得可重现的可扩展性。

 

UV和LC/MS兼容性的低流失
许多相显示有键合相的流失,当基线稳定性受到影响时,这可以在梯度条件下被最清晰地观察到。

尽管大多数超纯C18相可以预期产生低柱流失,但是需要谨慎选择替代选择性的键合相,以确保在低UV波长或LC/MS下进行分析时柱流失不会引起不可预见的问题。

需要注意的是,色谱柱的绝对流失取决于许多因素,并且可能会随时间和系统而变化。

因此,在比较色谱柱流失时,必须在受控条件下进行。

 

 

本实例对超纯ACE C18色谱柱(顶部)的低流失特性与PFP色谱柱(中间)的高流失特性进行了比较。

ACE C18-PFP色谱柱(底部)显示其流失水平与ACE C18相当,尽管后者包含可以提供替代选择性的完整PFP官能团。

 

UV流失的比较

 

 

在相同条件下对更宽范围的色谱柱的进一步分析证实,刢先的高纯度C18柱品牌显示出相似的低水平色谱柱流失。

然而,传统上推荐改变选择性的替代键合相(即苯基,极性嵌入式,PFP表面化学物质)的评估显示,所有这些非C18色谱柱均有显著更高的流失。
ACE C18-PFP将低流失水平(典型的
刢先C18色谱柱品牌)与替代选择性相结合,从而为分析者提供了有价值的方法开发工具。

当采用MS检测时,非C18相给分析者带来了传统上使用所出现的额外挑战。

在极端情况下,柱流失可能会污染检测器信号并掩盖重要分析物。
在以下实例中,在梯度运行的8-10分钟时段中监测柱流失,此时有机物的百分比增加至其最大水平,因此柱流失也是最高的。

MS Spectra(左边系列)提供了在该8-10分钟窗口中检测到流失的m/z裂解,而总离子色谱图(右边系列)阐明了在相同8-10分钟时间段内所获得的流失结果。

 

通过LC/MS分析,极性嵌入式色谱柱的TIC追踪和MS光谱(之前通过UV检测显示有显著流失)再次显示柱流失水平较高。

来自空白运行(在没有连接色谱柱的情况下开展)的MS光谱可以使背景系统流失量化。

ACE C18-PFP色谱柱和刢先的C18色谱柱均显示与空白运行相似的流失水平,这表明正在发生的柱流失可以忽略。

 

 

材料特性

a 为了获得蕞佳色谱柱寿命,推荐使用2-8的pH范围。为了在高pH值下增加色谱柱寿命,必须考虑有机缓冲液、低缓冲液浓度、高%有机溶剂和低温。

 

供货信息:

 

方法验证工具包
ACE相因具有出色的可重现性而得到了广泛认可。为了帮助进行方法验证,我们提供了一个方便的工具包,其中包含3个相同键合相和尺寸的色谱柱,填充有3个不同批次的硅胶。
方法验证工具包适用于所有相和色谱柱尺寸,其中最常见的工具包如下所示。

 

免费的HPLC技术指南和幻灯图片

请联系菲罗门

 

ACE是Advanced Chromatography Technologies的商标,Waters、SunFire、XBridge、Spherisorb和Symmetry是theWaters Corporation的商标,HyPurity、Hypersil BDS和Hypersil是Thermo Scientific的商标,Zorbax Eclipse、Zorbax XDB和Zorbax SB是Agilent Technologies的商标,Luna是Phenomenex Inc.的商标,Inertsil是GL Sciences的商标,以及Ascentis Express是Sigma-Aldrich Co的商标。
Advanced Chromatography Technologies与Waters Corporation、Thermo Scientific、Agilent Technologies、Phenomenex Inc.、GL Sciences或Sigma-Aldrich Co没有任何隶属关系。

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